細胞樣本的前處理

發(fā)布時(shí)間：2014/5/16 13:28:57　瀏覽次數：92952　[字號：大 中 小]　 [關(guān)閉此頁(yè)　打印此頁(yè)]

一、勻漿介質(zhì)

一般采用0.05?mol/L?Tris-HCl,?pH?7.4?磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶(hù)可根據樣本及測定指標的情況自行設定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境。

二、細胞樣本的前處理:

1、細胞沉淀的收集：

①?懸浮細胞:?對于懸浮培養的細胞，直接通過(guò)離心收集細胞沉淀，將培養液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。

②?貼壁細胞:?對于貼壁培養的細胞，用胰酶將細胞消化下來(lái)，或用細胞刮將細胞刮下來(lái)，將培養液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。

我們一般建議客戶(hù)，細胞密度最好不要小于一百萬(wàn)個(gè)/ml。

2、細胞沉淀的洗滌：

在細胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS?（等滲），?輕輕顛倒混勻，將培養液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。

重復上述操作反復洗滌1～2次。

3、勻漿的方式：手工勻漿，超聲破碎,裂解液裂解,反復凍融。

①?手工勻漿：在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據所測指標的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml），混勻，將細胞懸浮于PBS中，用移液器將細胞懸浮液移至玻璃勻漿管中（2ml玻璃勻漿管），將玻璃勻漿管置于冰水混合物中，手動(dòng)勻漿3分鐘，然后取破碎好的細胞懸浮液進(jìn)行測定。

②?超聲破碎:

在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據所測指標的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml），混勻，將細胞懸浮于PBS中，在冰水浴條件下進(jìn)行如下操作:

?????a、用超聲粉碎機進(jìn)行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用400安培，5秒/次，間隙10秒反復3～5次。

??????b、用超聲細胞破碎儀，300W功率，每次超聲3～5秒，間隔30秒，重復4～5次。

③?裂解液裂解?

常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的，或者說(shuō)作用力量強弱不同。

1、SDS屬于離子型去垢劑，最厲害，基本可以把細胞完全破掉，DNA會(huì )釋放出來(lái)，裂解液變得很粘稠。

2、NP-40是很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對核膜破壞的作用弱，結合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。

3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間，偏向于NP40，也是常用的細胞裂解液成分之一，在保護蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會(huì )使蛋白變性失活）。

去垢劑屬性只是一方面，buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關(guān)鍵因素

由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對酶活力的測定有一定的影響,一般不推薦用裂解液進(jìn)行裂解。

④?反復凍融:

在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據所測指標的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml），混勻，將細胞懸浮于PBS中，放低溫冰箱中結冰，溶解，再結冰，再溶解，反復3次左右）。

????????????????由于反復凍融對酶活力影響較大,一般不推薦使用

植物組織樣本的前處理

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